Acte I

Alors que tout le monde croit que Mitridate est mort lors d'une expédition guerrière à Pompée, les clés de la ville de Nymphée, en Tauride, sont remises à son fils Xipharès par le gouverneur Arbate. Xipharès regrette que son frère, Pharnace, ait été autorisé à revenir après avoir trahi son père. Une rivalité s'est installée entre les deux frères qui aiment tout deux Aspasie, une grecque qui devait épouser Mitridate. Arbate promet à Xipharès de lui être loyal. Entre alors Aspasie, qui le supplie de la protéger contre Pharnace, qui veut la forcer à l'aimer. Xipharès accepte et révèle son propre amour, auquel Aspasie offre un espoir (« Al destin, che la minaccia »). Xipharès se résout malgré tout à ne rien espérer d'elle en échange de sa protection (« Soffre il mio cor con pace »).

Peu après, alors que Pharnace inquiète une nouvelle fois Aspasie, les deux frères se querellent. Mais ils sont interrompus par le gouverneur Arbate, qui annonce que leur père, Mitridate, n'est en fait pas mort, et revient avec sa flotte de vaisseaux (« L'odio nel cor frenate »). Aspasie ne peut retenir ses larmes devant ce retour qui la condamne à un mariage qu'elle refuse (« Nel sen mi palpita dolente il core »). Alors que Pharnace suggère d'empêcher le retour de Mitridate, Xypharès s'y oppose et réaffirme sa loyauté envers son père (« Parto: Nel gran cimento »). Une fois son frère parti, Pharnace complote avec Marzio, un officier romain, une attaque romaine contre la Cité (« Venga pur, minacci e frema »).

Mitridate fait alors son apparition, revenant vaincu mais digne (« Se di lauri il crine adorno »), en compagnie d'Ismène, Princesse de Parthes. Il sermonne ses deux fils qui ont quitté, à l'annonce de sa mort, les contrées qu'il leur avait confiées. Il annonce à Pharnace qu'il le fiance à Ismène, qu'il aimait jadis, afin de disposer grâce à cette union, de nouveau soutiens pour affermir son trône. Devant la froideur de Pharnace, Ismène s'inquiète de souffrances futures (« In faccia all'oggetto »). Resté seul, Mitridate révèle au gouverneur Arbate qu'il a lui-même fait annoncer sa mort afin de tester la loyauté de ses fils, et lui demande comment ceux-ci se sont comportés. Arbate lui révèle alors que Pharnace s'est immédiatement précipité pour déclarer sa flamme à Aspasie, sans même lui laisser le temps de pleurer Mitridate, son fiancé décédé. Ces révélations provoquent la colère et la jalousie de Mitridate. Arbate loue alors la loyauté de Xypharès qui n'a accouru que pour défendre les terres de son père.

Acte II

Ismène reproche son désamour à Pharnace, qui lui avait pourtant juré fidélité. Celui-ci lui demande de ne pas provoquer le courroux de son père, qui le châtierait à coup sûr (« Va, l'error mio palesa »). Leur conversation est interrompue par l'entrée de Mitridate. Celui-ci apprend à Ismène qu'il entend châtier Pharnace pour son amour pour Aspasie, et qu'elle pourra se consoler en épousant Xypharès. Mais Ismène lui rétorque que c'est Pharnace qu'elle aime depuis toujours. Le Roi se tourne alors vers Aspasie, qu'il déclare vouloir épouser le jour même. Aspasie sous-entend alors qu'elle accepte à contrecœur, son amour s'étant porté sur un autre. Mitridate fait alors appeler Xypharès, à qui il demande son aide pour châtier son frère, coupable d'être aimé d'Aspasie (« Tu, che fedel mi sei »). A ces mots, Xypharès s'emporte contre Aspasie, qui l'assure de son amour éternel. Mais, consciente de son devoir, elle ordonne à Xypharès de disparaître à ses yeux (« Lungi da te, mio bene »). Restée seule, elle prend cependant la résolution d'essayer de convaincre Mitridate de la marier à Xypharès (« Nel grave tormento »).

Après avoir proposé à Ismène de l'épouser, Mitridate réunit un conseil au cours duquel il annonce son intention d'aller envahir Rome. Voyant Pharnace chercher à l'en dissuader, alors que Xypharès lui propose de conduire ses armées, Mitridate accuse son premier fils de trahison et le fait arrêter. Ismène approuve le châtiment (« So quanto a te dispiace »). Avant d'être emmené, Pharnace révèle cependant à son père l'amour qui unit Xypharès et Aspasie (« Son reo ; l'error confesso »). Mitridate décide alors de piéger Aspasie afin de connaître la vérité. Il annonce alors à sa fiancée son intention de lui faire épouser Xypaharès. Celle-ci lui avoue alors son amour pour ce fils fidèle. Mitridate, furieux, promet alors de faire couler le sang de ses fils et de sa fiancée (« Già di pietà mi spoglio »). Aspasie et Xypharès décident de mourir ensemble (« Se viver non degg'io »).

Acte III

Alors qu'Aspasie a tenté de mettre fin à ses jours, Ismène conseille à Mitridate de faire preuve de clémence, lui rappelant qu'elle souffre elle-même d'un amour trahi (« Tu sai per chi m'accese »). Mitridate propose alors de nouveau à Aspasie de l'épouser, mais celle-ci refuse, fidèle à Xypharès. Elle demande au Roi de la punir et de pardonner à son fils. Mitridate décide de frapper les deux amants. Mais il est interrompu par le gouverneur Arbate qui annonce que l'armée romaine attaque la ville. Mitridate part au combat, non sans condamner à mort Xypharès et Aspasie (« Vado incontro al fato estremo »).

Alors qu'Aspasie s'apprête à boire la coupe de poison, s'imaginant Xypharès faisant de même, celui-ci apparaît et interromps son geste. Il lui explique avoir été libéré par Ismène et partir mourir en héros au combat (« Se il rigor d'ingrata sorte »). Dans sa prison, Pharnace regrette que le sort le prive ainsi du trône auquel sa naissance le prédestinait. Arrive Marzio qui lui relate le débarquement des troupes romaines et leur assaut victorieux. Pharnace est libéré, le trône et la vengeance lui sont promis (« Se di regnar sei vago »). Resté seul, Pharnace se voit cependant rongé de remords à l'idée de la trahison de son père. Il décide de retrouver une conduite plus noble (« Già dagli occhi il velo è tolto »).

Mitridate entre alors, mortellement blessé, après avoir retourné son arme contre lui pour ne pas se voir vaincu par les romains. Réunissant ses dernières forces, il bénit son fils Xypharès venu à son secours, prouvant ainsi sa loyauté et son courage. Il lui confie le trône, ainsi que la main d'Aspasie. Il redit en revanche son souhait de voir Pharnace châtié. Ce dernier est cependant défendu par Ismène qui explique que ce dernier s'est finalement retourné contre les romains qui l'avaient pourtant libéré, préférant redevenir fidèle à son père. Mitridate meurt heureux, réconcilié avec ses deux fils. Xypharès, Pharnace, Arbate, Ismène et Aspasie jurent alors de continuer le combat face aux romains (« Non si ceda al Campidoglio »).