Dans un luxuriant jardin entourant un pavillon de style gothique, Iolanta, la fille du Roi Renée, cueille des fruits, les cherchant à tâtons du fait de sa cécité. Elle s’ouvre à sa préceptrice, Martha, du manque qu’elle ressent, sans parvenir à l’identifier. Alors que Martha s’en émeut, Iolanta lui touche les yeux et constate que des larmes y coulent. Martha lui faisant remarquer qu’elle pleure également, Iolanta s’étonne que celle-ci n’aie pas eu à lui toucher le visage pour le constater. Ses deux servantes, Brigitta et Laura, tentent alors de la distraire. Martha et les deux servantes lui chantent une berceuse. Fatiguée, Iolanta s’endort.

Bertrand, le gouverneur du pavillon et mari de Martha, interpelle un étranger ayant pénétré dans le domaine. Ce dernier se présente comme le nouvel officier du Roi, Alméric, venant délivrer les ordres de ce dernier. Bertrand explique à Alméric que Iolanta vit recluse dans cette propriété, ignorante de son handicap et de son statut, le Roi souhaitant cacher sa cécité au Duc Robert, à qui elle est promise jusqu'à ce qu’elle guérisse. Alméric annonce l’arrivée prochaine du Roi, accompagné d’un médecin maure.

Un appel de cor retentit alors, annonçant l’arrivée du Roi. Ce dernier paraît en effet, accompagné du docteur Ibn-Hakia. Ce dernier est aussitôt conduit à Iolanta, toujours endormie, afin de l’ausculter. Le Roi déclare être prêt à donner sa vie pour que sa fille tant aimée retrouve la vue. Ibn-Hakia revient et annonce que pour recouvrer la vue, Iolanta devra être informée de son handicap et éprouver un profond désir de guérir. Le Roi refuse catégoriquement de soumettre sa fille au malheur que la connaissance de sa cécité constituerait, sans garantie qu’elle en guérisse ensuite : il renouvelle l’interdiction de révéler le secret de Iolanta sous peine de mort.

Peu après, le Duc Robert et son compagnon, le Comte Vaudémont, pénètrent dans le domaine, malgré l’inscription les informant de la peine encourue. Robert insiste pour qu’ils s’arrêtent dans ce jardin paradisiaque, peu pressé de finir son voyage qui le mène au Roi René, dont il doit épouser la fille. Lui ne vit en effet que pour une jeune femme à la beauté voluptueuse, Mathilde. Vaudémont, lui, rêve d’une femme douce et pure, telle que le monde n’en connait guère. Explorant les alentours, ils aperçoivent Iolanta endormie. Vaudémont en tombe instantanément amoureux. Alors que la jeune femme s’éveille, Robert presse Vaudémont de quitter les lieux, craignant un piège. Ce dernier refusant de s’éloigner, Robert part chercher ses hommes en renfort afin de protéger son ami. Pendant ce temps, Vaudémont déclare sa flamme à Iolanta qui s’en offusque. Vaudémont accepte alors de la quitter mais réclame qu’elle lui cueille une rose rouge qu’il puisse garder en souvenir. Mais la jeune femme ne comprenant pas ce qu’est le rouge, il comprend et lui révèle sa cécité. La surprise le gagne en constatant qu’elle ignore son handicap. Le Comte lui révèle alors la merveille qu’est la lumière, charmant Iolanta par ses paroles.

Le Roi, Ibn-Hakia, Martha et le reste de la cour entrent alors, constant avec désarroi la présence d’un étranger. Iolanta, heureuse, annonce que Vaudémont lui a appris la beauté de la lumière. Ibn-Hakia réconforte le Roi, effondré, lui indiquant que la première condition à la guérison de sa fille était à présent remplie : mais il reste à Iolanta de désirer ardemment recouvrer la vue. Celle-ci rétorque qu’elle ne peut désirer ce qu’elle ne conçoit pas. Le Roi, comprenant l’importance de susciter ce désir chez sa fille, condamne Vaudémont à mort pour être entré sur ses terres malgré l’interdiction, cette condamnation ne pouvant être levée que par la guérison de sa fille. Celle-ci, désespérée, ordonne à Ibn-Hakia de démarrer son traitement, prête à tout pour sauver le chevalier étranger.

Iolanta sortie, Renée annonce à Vaudémont que sa condamnation n’était qu’une feinte pour inciter sa fille à désirer guérir. Vaudémont, ignorant l’identité du Roi, se présente et lui demande la main de sa fille. Le Roi refuse sa demande au moment même où Robert fait son entrée, entouré de soldats. Alors que chacun comprend la véritable situation, Robert demande au Roi de le délier de sa promesse, son cœur appartenant à une autre femme. Le Roi peut alors donner sa fille à Vaudémont.

Bertrand entre et annonce que Iolanta a recouvré la vue. Ibn-Hakia la conduit en effet. Interloquée, la jeune femme peine à reconnaître les lieux et les personnes qui l’ont entourée si longtemps. Tous rendent gloire à Dieu.