Acte I

En 1922 au cabinet de Maître Kolenatý, le clerc Vitek attend le verdict de l’affaire Gregor contre Prus, qui trouve ses origines un siècle plus tôt (« Ach je, ach bože ! »). Justement, Albert Gregor, le requérant, paraît (« Občane Marate ! »), suivi de peu par Kristina, la fille de Vitek, sous le charme d’une chanteuse du nom d’Emilia Marty (« Táti, ta Marty je ohromná »). Maître Kolenatý arrive enfin, justement accompagné d’Emilia Marty. A la demande de cette dernière, Kolenatý explique que l’affaire en cours concerne l’héritage de Ferdinand Joseph Prus (dit Pepi Prus), décédé en 1827 : sans enfant, ses biens sont revenus à son cousin Emerich Prus. Mais un certain Ferdinand Gregor prétendait que le défunt lui léguait ses biens. Semblant connaître les protagonistes, Emilia affirme que ce Ferdinand Gregor est le fils de Pepi Prus et d’une femme nommée Ellian MacGregor, et donne des indications pour retrouver un testament mettant tout cela au clair (« Tady prosím, jenom račte »).

Alors que Kolenatý part à la recherche du précieux document, Gregor se sent dévoré d’amour, mais est repoussé par Emilia, qui lui réclame de mystérieux écrits grec présents chez Prus en récompense des informations données (« Dobře, Gregore ! »). Kolenatý reparaît alors avec le testament en main. Le Baron Jaroslav Prus, détenteur de l’héritage, lui emboîte le pas, demandant une preuve que le Ferdinand mentionné dans le testament est bien Ferdinand Gregor, aïeul d’Albert Gregor (« Našli jsme ! Našli ! »).

Acte II

Le soir, dans la loge d’Emilia à l’opéra, un Machiniste discute avec une Femme de ménage de l’ovation reçue par la cantatrice (« Viděli ty ktyice ? »). Kristina rôde avec son amant Janek, qui n’est autre que le fils de Jaroslav Prus (« Janku, pojd’ sem ! »). Justement, ce dernier paraît peu après Emilia. Ils sont rapidement rejoints par Albert Gregor et Vitek : tous sont intrigués par Emilia (« Non sto guardando ! »). Un vieil admirateur, le Comte Hauk-Sendorf, reconnait en elle une gitane qu’il avait aimée 50 ans plus tôt sous le nom d’Eugenia Montez (« Dovolte, dovolte, prosím »).

La jeune femme renvoie tous ses visiteurs à l’exception de Jaroslav Prus : ce dernier fait le lien entre Ellian MacGregor et une certaine Elina Makropoulos, désignée dans le registre des naissances comme la mère de Ferdinand Gregor. Il mentionne également une enveloppe cachetée, conservée avec le testament, qui semble attirer l’attention d’Emilia (« Dovolte mi dřive otázku »). A peine est-il parti que revient Albert Gregor qui lui proclame sa flamme : Emilia jure de ne jamais l’aimer en retour (« Tos ty, Bertíku ? »). Puis vient Janek Prus, lui aussi follement amoureux d’Emilia : cette dernière lui demande de voler la mystérieuse enveloppe à son père. Mais Jaroslav Prus paraît justement et chasse son fils : il accepte de lui donner la lettre en échange d’une nuit d’amour (« To jsi ty, Bertíku ? »).

Acte III

Au matin, Jaroslav Prus se réveille chez Emilia Marty : déçu de l’amour glacial reçu, il livre tout de même la lettre. C’est alors qu’il apprend le suicide de son fils Janek, qui ne semble pas émouvoir Emilia (« Nu ? Slyšíte ? Dejte mi tu obálku ! »). Alors que le Comte Hauk-Sendorf propose à Emilia de fuir avec lui (« Buenos dias , Maxi ! »), Maître Kolenatý, Albert Gregor, Vitek et Kristina surgissent, la confrontant à de nombreux détails suspects et lui reprochant la mort de Janek (« Prosím, slečno, to nedělejte ! »). Emilia révèle être née en 1585 sous le nom d’Elina Makropoulos : son père a conçu un élixir de vie qu’il a testé sur elle. C’est la formule de cet élixir qui est inscrite sur la lettre cachetée, qu’elle est venue récupérer, sentant sa mort approcher (« Ted’ už jsi má »). Elle renonce toutefois à prolonger de nouveau sa vie et donne la formule à Kristina qui la brûle. Emilia tombe, morte (« Cítila jsem že smrt ne mne sáhala »).