Acte I

Oroe, le Grand Prêtre de Baal, est informé par le dieu d’un grand secret. Le peuple de Babylone se rassemble dans le temple avec des chants de louange (« Belo si celebri, Belo si onori »). Les princes Idreno et Assur s’affrontent, ambitionnant tout deux d’épouser Azema, la fille de Semiramide, la Reine de Babylone dont le mari Nino est mort : ce mariage doit donner accès au trône (« Là dal Gange a te primiero »). Justement, la Reine dont la décision est attendue, paraît (« Ah, ti vediamo ancor »). Mais, alors que celle-ci s’apprête à s’exprimer, le feu sacré s’éteint dans un grondement sourd, plongeant l’assemblée dans la stupeur (« Ah! già il sacro foco è spento »).

Alors que le temple se vide, Arsace paraît, appelé à Babylone par un ordre de son père mourant, par une demande urgente de Semiramide, et par son cœur impatient de retrouver Azema dont il est amoureux depuis qu’il a sauvé sa vie (« Ah, quel giorno ognor rammento »). Oroe l’accueille et lui apprend que son père, le Roi Nino a été trahi et empoisonné. Ils sont cependant interrompus par Assur, qui comprend bien vite qu’Arsace est amoureux d’Azema, qui fut promise au prince disparu Ninia : il se pose en rival (« Bella immago degli Dei »).

Idreno vient trouver Azema, qui lui assure que jamais Assur n’aura son cœur : Idreno s’en trouve rassuré (« Ah ! dov'è, dov'è il cimento ? »). Elle convient pour elle seule qu’en dehors d’Arsace, qu’elle aime, seul Idreno serait digne d’elle. Semiramide paraît alors, se réjouissant du retour d’Arsace (« Serena i vaghi rai »). Un message d’Oroe prophétise qu’elle retrouvera la paix dans un nouveau mariage, ce qui la comble de joie. Justement, Arsace paraît : la Reine et lui se dévoilent leurs sentiments à mots couvert, ce qui provoque un quiproquo, la Reine pensant qu’elle est l’objet de l’amour d’Arsace tandis que ce dernier pense qu’elle lui promet la main d’Azema (« Serbami ognor si fido »).

La foule et les mages se rassemblent pour accueillir la Reine (« Ergi omai la fronte altera »).  Chacun ayant juré de respecter son choix, la Reine annonce qu’Arsace sera à la fois le prochain roi, mais aussi son époux. Alors qu’elle accepte de donner la main d’Azema à Idreno, un éclair l’interrompt (« I vostri voti ornai »). Le spectre de Nino apparaît alors, semant la terreur (« La tomba scuotesi ! »). Il prophétise la future accession au trône d’Arsace, lorsque les crimes auront été expiés et que le sang d’une victime lui aura été offert en sacrifice (« D'un semidio che adoro »).

Acte II

Le chef de la Garde, Mitrane, introduit Assur auprès de Sémiramide. Ce dernier reproche à la Reine de ne pas l’avoir nommé Roi et époux comme elle le lui avait promis jadis, lorsqu’ils assassinèrent Nino. Mais Sémiramide espère qu’Arsace saura la racheter auprès des dieux : Assur promet de se venger (« Se la vita ancor t'è cara »).

Dans le sanctuaire, Oroès et les mages accueillent Arsace (« In questo augusto »). Ce dernier apprend alors sa véritable identité : il est en fait Ninia, le Prince disparu promis à Azena. Oroès lui apporte également la preuve qu’Assur et Sémiramide sont responsables de la mort de son père Nino. Arsace promet de se venger d’Assur, mais espère obtenir le pardon des dieux pour Semiramide (« In si barbara sciagura »).

De son côté, Azema se désespère à la pensée qu’Arsace puisse épouser Sémiramide plutôt qu’elle. Idreno la surprend et lui redit l’amour qu’il porte, tandis que la foule vient les chercher pour les emmener à l’autel (« La speranza più soave »). Arsase montre à Sémiramide la preuve de son crime : ils restent tout deux glacés d’effroi. Arsace refuse de commettre un matricide pour venger son père (« Giorno d'orror ! »).

Assur descend dans le mausolée de Nino afin d’y trouver Arsace, le tuer et récupérer le trône. Mais il est de nouveau confronté à un spectre qui le terrorise (« Deh ! ti ferma, ti placa, perdona ! »). Arsace descend à son tour, près à offrir à son père le sang du meurtrier. Il est lui-même suivi de Sémiramide qui entend protéger son fils. Perdus dans l’obscurité, tous peinent à garder courage. Soudain, Arsace, pensant fraper Assur, tue sa mère. Le Grand-Prêtre Oroès fait arrêter Assur. Déjà, le peuple acclame son nouveau Roi (« Qual densa notte ! »).