Acte I

Sur les rives d’un vaste lac, trois ondines moquent le Génie des eaux, qui les courtise en vain (« Hou, hou, hou, stojí měsíc nad vodou ! »). Ce dernier, Vodnik, se voit en effet repoussé (« I pěkně vítám z lesa k jezeru ! »). Sa fille Rusalka s’approche et lui avoue vouloir quitter les eaux pour devenir humaine et mortelle, et ainsi avoir une âme et pouvoir aimer et enlacer le Prince qui parfois vient se baigner dans le lac : Vodnik la met en garde. Mais sachant qu’il ne pourra pas le retenir, il lui conseille de se tourner vers la sorcière Jezibaba (« Hastrmánku, tatíčku »). Restée seule, Rusalka chante une ode à la Lune, lui confiant son amour pour le Prince et espérant apparaître dans ses rêves (« Měsíčku na nebi hlubokém »). Elle en appelle à Jezibaba (« Ta voda studí, ó studí ! »). La sorcière accepte de l’aider, mais la prévient : humaine, elle souffrira et sera muette, et ne pourra revenir à sa condition initiale que réprouvée, provoquant au passage la malédiction sur son bien-aimé (« To já znám »). Rusalka acceptant ces conditions, Jezibaba prépare la potion (« Čury mury fuk »).

Sur la berge, un Chasseur chante (« Jel mladý lovec »), précédant de peu le Prince, attiré là par une sorte d’envoûtement  (« Zde mihla se a zase zmizela »). Dès qu’il aperçoit Rusalka, il en tombe amoureux (« Vidino divná, přesladká ») et lui demande de rester auprès de lui (« Vím, že jsi kouzlo »).

Acte II

Au palais du Prince, les commérages vont bon train entre le Marmiton et son oncle Vanek, le Garde-Chasse (« Jářku, jářku, klouče milé »). Ce dernier affirme même que la forêt est maintenant hantée (« U nás v lese straší »).

Tandis que le Prince cherche à percer le secret de sa mystérieuse fiancée muette et glacée, une Princesse étrangère, bien que n’éprouvant aucun sentiment pour lui, laisse éclater sa jalousie vis-à-vis de Rusalka (« Již týden dlíš mi po boku »). Elle entreprend dès lors de séduire le Prince, moquant le mutisme de Rusalka (« Ach, výčitka to věru včasná »).

Dans la salle de bal, les invités aux noces paraissent. Vodnik, le Génie des eaux, regrette le sort malheureux de sa fille (« Běda ! Běda ! »). Sa mélancolie se heurte à la gaité des convives (« Květiny bílé po cestě »). Rusalka le trouve alors et lui confie ses malheurs, prise entre deux mondes, ne pouvant ni vivre ni mourir, rejetée des humains mais maudite par le monde aquatique (« Rusalko, znáš mne, znáš ? »). De son côté, le Prince déclare son ardente flamme à la Princesse étrangère, rejetant définitivement Rusalka. Vodnik entraîne alors sa fille dans les eaux, maudissant le Prince, qui est aussitôt rejeté par la Princesse étrangère (« 0 Vám v očích divný žár se zračí »).

Acte III

N’appartenant plus au monde aquatique, Rusalka s’y sent dépérir, tout en étant condamnée à vivre (« Necitelná vodní moci »). Elle en appelle de nouveau à a sorcière Jezibaba, qui lui affirme que la malédiction qui pèse sur elle ne prendra fin que si elle verse le sang de l’humain qui l’a trahie. Rusalka se refuse à acheter son salut par un tel crime (« Aj, aj? Už jsi se navrátila ! »). Abandonnée par ses comparses, elle est condamnée à l’errance solitaire (« Vyrvána životu »). 

Tandis que le Garde-Chasse et son neveu le Marmiton viennent demander son aide à Jezibaba, le Prince et son château restant sous l’effet d’un maléfice depuis le passage de Rusalka, le Génie des eaux les fait fuir, promettant à l’espèce humaine de venger le sort de sa fille trahie (« Že se bojíš ? Třesky, plesky ») 

Au fond des eaux, les dryades vantent leur beauté, mais leur père les interrompt, criant son malheur (« Mám zlaté vlásky, mám »). Sur la berge, le Prince appelle Rusalka (« Bila moje lani ! »). Cette dernière lui apparaît : le Prince lui réclame un baiser, dû-t-il lui coûter la vie. Rusalka l’embrasse : le Prince expire. Rusalka est emportée dans les profondeurs du lac, tandis que Vodnik pleure sur le sort de sa fille (« Miláčku, znáš mne, znáš ? »).