Nathalie Dessaix naît à Lyon le 19 avril 1965. Elle grandit près de Bordeaux où elle rencontre une choriste du chœur de l'Opéra National de Bordeaux, Madame Saintrais, qui l'amène sur le chemin de l'art lyrique. C'est ainsi en Gironde, au cours d'une pièce de théâtre (activité qu'elle pratique assidument), que sa voix est repérée et qu'elle commence à prendre des cours de chant. A 20 ans, elle reçoit un premier prix du Conservatoire de Bordeaux avant d'intégrer le Chœur du Théâtre du Capitole de Toulouse.

A la fin des années 1980, l'Opéra de Paris l'invite à rejoindre son école d'art lyrique et lui offre d'interpréter l'Elisa du Re Pastore de Mozart. Sur la scène de l'opéra Bastille, elle est Olympia dans les Contes d'Hoffman d'Offenbach en 1992. Elle remporte le premier prix du Concours Mozart puis intègre la prestigieuse troupe de l'Opéra National de Vienne. En 1994, la chanteuse crée son nom de scène (elle supprime notamment le « h » de son prénom en hommage à Natalie Wood, une actrice américaine) et signe son premier contrat d'exclusivité avec EMI Classics. Elle incarne la même année à Aix-en-Provence la Reine de la Nuit, dans la Flûte enchantée de Mozart. Les scènes internationales lui ouvrent alors leurs portes : elle est tour à tour Madame Herz (Der Schauspieldirektor de Mozart), Lakmé de Leo Delibes, Adèle (La Chauve-souris de Johan Strauss), ou bien encore Zerbinette (Ariane à Naxos de Richard Strauss) qu'elle interprète malgré sa réticence à aborder des rôles techniquement complexes. Son point fort : sa formation de comédienne qui lui confère de belles capacités d'interprétation.

Après une opération des cordes vocales, elle change de répertoire et approche davantage des rôles plus tragiques. En 2001, elle interprète Lucia di Lammermoor de Donizetti à Lyon, un défi qu'elle s'était fixé une dizaine d'années auparavant. L'heure de la reconnaissance sonne en mars 2008 lorsqu'elle reçoit le prestigieux Laurence Olivier Award pour sa performance éclatante dans La Fille du Régiment au Covent Garden de Londres aux côtés de Juan Diego Florez. Six fois consacrée aux Victoires de la Musique Classique, elle est aussi nommée Chevalier de la Légion d'Honneur en 2011. La même année, elle est lauréate du prix Grand Siècle de Laurent Perrier, incarnant, à l'image du ténor italien Luciano Pavarotti, l'aspiration de mettre l'art à la portée de tous. Epuisée vocalement, Natalie Dessay se voit contrainte d'annuler nombre de prestations, dont trois des quatre personnages féminins qu'elle devait incarner en février 2013 dans Les Contes d'Hoffmann d'Offenbach au Liceu de Barcelone. Elle n'y conserve que le rôle d'Antonia.

Sa carrière prend un nouveau tournant en 2013. S'estimant trop âgée pour les rôles de jeunes filles qui concordent avec sa tessiture, elle fait ses adieux à l'opéra pour se consacrer au théâtre et à la chanson. Elle signe un album de reprises de chansons de Michel Legrand la même année, puis un second, Rio Paris, en 2014 en collaboration avec Hélèna Noguerra, Agnès Jaoui et Cohen Liat. En parallèle, elle fait ses premiers pas dans les studios de France Inter où elle anime une émission radio consacrée à la musique. Elle y a à cœur de faire découvrir et aimer les grands classiques. En mai 2015, elle monte sur les planches du théâtre Olympia de Tours pour y jouer Und de Howard Barker mis en scène par Jacques Vincey. De Mozart à Michel Legrand, Natalie Dessay sort en novembre 2014 un album compilant le meilleur de ses vingt années de carrière lyrique. En 2020, elle édite un album dédié à Claude Nougaro en collaboration avec Yvan Cassar.