Juan-Diego Flórez naît le 13 janvier 1973 à Lima. Il est le fils de Ruben Flórez, un chanteur de musique traditionnelle péruvienne. Cette influence marque les débuts de sa carrière musicale, alors qu'il interprète des compositions teintées de pop, rock et musique péruvienne dans des bars de Lima. En 1990, il entre au Conservatoire national de Musique du Pérou. Il se passionne pour la musique lyrique classique suite à sa rencontre avec le chef Andrés Santa Maria, dont il intègre le chœur. Puis il obtient une bourse pour étudier au prestigieux Institut de Musique Curtis, à Philadelphie, où il obtient ses premiers rôles. En 1994, Juan-Diego Flórez rencontre le ténor péruvien Ernesto Palacio, qui l'invite sur deux enregistrements et devient son mentor. En 1996, alors qu’il répète un petit rôle de Ricciardo e Zoraide, dans le cadre du Festival Rossini à Pesaro, le ténor devant interpréter Corradino dans Mathilde de Shibran pour ce même festival tombe malade. Juan-Diego Flórez le remplace au pied levé. Le succès qui s'ensuit lui ouvre les portes des plus grandes scènes mondiales : il fait par exemple ses débuts à Paris dans L'Italienne à Alger en 2000.

Il marque l'histoire de La Scala de Milan en 2007 en donnant un bis de l'aria « Ah mes Amis » extraite de La Fille du régiment de Donizetti : aucun bis n'avait pourtant retenti à La Scala depuis 1933. Tonio devient son rôle le plus emblématique. En 2012, il chante Nemorino dans L'Elixir d'amour de Donizetti à Vienne. Très engagé en faveur de l'éducation musicale au Pérou, il est désigné la même année ambassadeur de bonne volonté de l'Unesco. Le Péruvien interprète en 2013 trois nouveaux rôles rossiniens : le rôle-titre du Comte Ory au Met, Arnold dans Guillaume Tell au Festival International de l'Opéra de Lime (Pérou), et Giacomo V dans La Dame du lac au Royal Opera House. Il chante aussi Nadir dans une version concert des Pêcheurs de perles de Bizet au Théâtre royal de Madrid. Le Liceu le reçoit en 2014 pour La Somnambule de Bellini (Elvino), ainsi que Don Ramiro dans La Cenerentola au Met et Almaviva dans Le Barbier de Séville à Munich.

Flórez amorce un virage en 2014 en sortant un disque entièrement en français, comportant des morceaux extraits d'œuvres aussi diverses que Werther de Massenet, Roméo et Juliette de Gounod (chanté à Lime la même année) ou Les Troyens de Berlioz. En 2015, il est Ernesto dans Don Pasquale de Donizetti à Vienne. La Scala le reçoit ensuite en Rodrigo dans Otello de Rossini. Il chante ensuite le rôle du Duc de Mantoue dans Rigoletto de Verdi à Vienne, ainsi que le rôle-titre masculin d'Orphée et Eurydice de Gluck donné au Royal Opera House. En 2016, le TCE l'accueille pour sa prise du rôle-titre de Werther en version concert (qu'il rechante en version scénique l'an suivant pour ses débuts à Zürich), et Berlin l’invite à chanter Raoul dans Les Huguenots de Meyerbeer. En 2017, le Péruvien est Gennaro dans une version concert de Lucrèce Borgia de Donizetti au Festival de Salzbourg. L’année suivante, Monte-Carlo le reçoit dans le rôle-titre des Contes d'Hoffmann d'Offenbach puis il se rend à Munich pour interpréter Edgardo dans Lucia di Lammermoor de Donizetti. Toujours en 2018, il prend le rôle d'Alfredo Germont dans La Traviata au Met, avant de prendre en 2019 celui de Des Grieux dans Manon au TCE en version concert puis à Vienne en version scénique. La crise du Covid-19 lui aurait tout juste laissé le temps de prendre le rôle de Rodolfo dans La Bohème à Zürich en 2020, seule la Première ayant pu être jouée. 

En 2020/2021, Juan-Diego Flórez consacrera la majeure partie de sa saison aux récitals (il passera notamment à Liège en janvier). L'Opéra de Vienne l'accueillera toutefois à deux reprises dans le répertoire français, pour sa prise du rôle-titre de Faust de Gounod en avril et pour le rôle-titre des Contes d'Hoffmann en mai.